10年前，Illumina基因組測序技術(shù)進入市場時，前所未有的龐大數(shù)據(jù)量淘汰了較早開發(fā)的測序分析工具。

歷史總是重演。如今，第三代測序技術(shù)已經(jīng)達到低成本群體測序規(guī)模的臨界點。

12月10日，《自然—方法學(xué)》在線發(fā)表了第一個能夠跟上基因組測序產(chǎn)生速度的組裝算法。

論文作者、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所博士阮玨與美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士李恒，將這個新的第三代測序數(shù)據(jù)組裝算法稱為Wtdbg。

第三代測序的尷尬

20年前，破譯人類遺傳密碼還是極具挑戰(zhàn)的大科學(xué)工程，當(dāng)時的人類基因組測序計劃與曼哈頓原子彈計劃、阿波羅計劃并稱為三大科學(xué)計劃。

如今，完成一個人的全基因組測序已經(jīng)是普通實驗室甚至家庭都可以負(fù)擔(dān)起費用的“平常事”。用第三代測序技術(shù)完成個體全基因組測序僅需一天，費用也已經(jīng)低于5萬元。

2011年，PacBio公司正式宣布第三代單分子測序開始商業(yè)化。相比于第二代測序每個序列的幾百堿基對測序讀長，第三代測序的平均讀長達到了幾萬堿基對，最長可以達到數(shù)百萬堿基對。

西北工業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院教授邱強告訴《中國科學(xué)報》，這一技術(shù)出現(xiàn)時，科研人員期待利用它填補基因組序列中高重復(fù)高雜合的區(qū)域，挑戰(zhàn)高難度的基因組。然而，人們迅速發(fā)現(xiàn)，這一新技術(shù)的普及和應(yīng)用遇到了很大的困難。

“主要有兩個原因：第三代測序的成本在初期要遠高于第二代測序;由于第三代測序錯誤率較高，此前用于第二代基因組測序的組裝方法紛紛失效，缺乏有效率的組裝工具，特別是PacBio官方推出的falcon方法，消耗資源極多。”邱強介紹，數(shù)年后，Ont公司推出納米孔測序技術(shù)，市場競爭逐漸拉低了第三代測序的成本。而在基因組組裝方面，盡管已經(jīng)出現(xiàn)了canu、marvel等多個組裝軟件，“但組裝仍然是一個十分費時費力的過程，一個哺乳動物基因組的組裝時間要數(shù)周”。

以人類基因組組裝為例，在2014年需要消耗50萬個CPU小時，只能在超大計算機集群上進行。“這種情況下，同時對大量個體進行組裝分析是難以想象的。”但現(xiàn)實是，“以全基因組組裝方式對群體進行測序分析已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究的趨勢。”阮玨說。

首次：數(shù)據(jù)分析比產(chǎn)生更快

“wtdbg和即將推出的工具可能會從根本上改變當(dāng)前測序數(shù)據(jù)分析的實踐。”阮玨在接受《中國科學(xué)報》采訪時說。

此前，“數(shù)據(jù)產(chǎn)出速度遠高于數(shù)據(jù)分析速度。”因此，近年來，生物信息學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家群體致力于改變這種尷尬狀況，不斷開發(fā)出更高效的組裝分析算法。

例如，繼falcon、canu等算法之后，2019年4月，美國加利福尼亞大學(xué)圣迭戈分校NIH計算質(zhì)譜中心主任Pavel A. Pevzner在《自然—生物技術(shù)》上發(fā)表了Flye算法，其速度遠高于falcon、canu。

而阮玨和李恒正式發(fā)表的第三代測序數(shù)據(jù)組裝算法wtdbg，比之Flye算法，分析速度提升了5倍，也首次讓數(shù)據(jù)分析時間少于產(chǎn)出時間。

西北工業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院的科學(xué)家已經(jīng)用wtdbg組裝了十多個哺乳動物基因組。西北工業(yè)大學(xué)教授陳壘在接受《中國科學(xué)報》采訪時說：“我們用過falcon和canu等組裝方法，相比較而言，wtdbg組裝運算時間最快，占用資源少，能節(jié)省大量時間。組裝出的基因組連續(xù)性很高，組裝質(zhì)量均符合現(xiàn)在主流的基因組評估。”特別是，對超大型基因組的組裝，wtdbg應(yīng)該是目前為數(shù)不多的可以高效使用的組裝軟件。

“對于人類基因組數(shù)據(jù)，wtdbg比已發(fā)布的工具快幾十倍，同時實現(xiàn)了相當(dāng)?shù)倪B續(xù)性和準(zhǔn)確性。它代表了算法上的重大進步，并為將來群體規(guī)模的組裝分析鋪平道路。”阮玨說。

模糊布魯因圖問世

上世紀(jì)90年代，Pavel A. Pevzner將德布魯因圖引入了基因組組裝領(lǐng)域。德布魯因圖是一個展示符號序列之間重疊關(guān)系的有方向的圖。阮玨介紹，由于第二代測序錯誤率低，大部分短串(k-mer)是正確的，相同的短串間可以利用德布魯因圖的原理合并起來構(gòu)成組裝圖。

但第三代測序數(shù)據(jù)的錯誤率非常高，如果還是使用短串k-mer的話，大部分短串帶有測序錯誤，不可以合并起來。因此，德布魯因圖從未成功應(yīng)用在第三代測序數(shù)據(jù)。

突破性的方法基于突破性的理論基礎(chǔ)。

2013年開始，阮玨和李恒著手解決第三代測序組裝的問題，分別開發(fā)的SMARTdenovo和Miniasm在領(lǐng)域內(nèi)均有較好的表現(xiàn)。隨后在德布魯因圖基礎(chǔ)上，設(shè)計出一個新的組裝圖理論——模糊布魯因圖。

他們重新定義了“短串”，將測序數(shù)據(jù)切分為固定長度的新型短串k-bin，k-bin比k-mer的長度更長。“新設(shè)計的模糊布魯因圖能夠容忍高噪聲數(shù)據(jù)，并隨后對生成組裝圖與恢復(fù)基因組序列做了大量相應(yīng)的重構(gòu)，使其兼具高效率和高容錯的優(yōu)點。”阮玨說。

“一般軟件組裝第三代測序數(shù)據(jù)的思路是，先對測序數(shù)據(jù)進行比對糾錯，再進行基因組序列的構(gòu)建。”邱強說，wtdbg則直接進行基因組組裝，避免了需要提前糾錯的耗時步驟，直接得到一個相對可靠的組裝結(jié)果。

“組裝費時費力這一問題的真正改善，正是從阮玨和李恒研發(fā)的wtdbg算法開始。”邱強說。在他們的課題組中，wtdbg算法得到了廣泛使用，極大提高了工作效率。不僅如此，他們還與阮玨進行了深入溝通，對超大基因組組裝進行了優(yōu)化，“我們得以獲取40G左右的高質(zhì)量基因組序列”。

公眾參與下的技術(shù)改進

2016年，為了讓基因組測序領(lǐng)域可以及時使用新技術(shù)，阮玨和李恒將wtdbg研究成果免費開放。

3年來，wtdbg不僅被幾十篇學(xué)術(shù)論文引用，還被國內(nèi)多家基因組測序分析公司作為主要組裝分析工具，并且在2019年世界大學(xué)生超算競賽中作為性能測試賽題。

“我們通過郵件、GitHub網(wǎng)站等方式收到大量反饋，這些反饋不僅幫助我們修訂算法軟件中的漏洞，還帶來了新的想法和思路。換個角度來講，現(xiàn)在發(fā)表的論文已經(jīng)經(jīng)歷了3年多的‘公眾審稿’，感謝多年來參與和關(guān)注wtdbg開發(fā)的同行。”阮玨說。

邱強認(rèn)為，wtdbg算法不僅相對于更早的falcon、canu等算法具有效率和準(zhǔn)確性的優(yōu)勢，相比此后出現(xiàn)的flye等組裝算法也更可靠。“這一研究成果表明我國在基因組算法領(lǐng)域具有了引領(lǐng)國際的實力，也代表了我國科技發(fā)展的軟實力。”(李晨)

關(guān)鍵詞： 基因組組裝算法